* Η υπόθεση ότι όλοι οι χαρακτήρες είναι ετεροφυλόφιλοι. Αυτό είναι εμφανές στον τρόπο που οι χαρακτήρες μιλούν για την αγάπη και τις σχέσεις και στον τρόπο που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Για παράδειγμα, όταν η Βιόλα μεταμφιέζεται σε άντρα, υποτίθεται αμέσως ότι είναι ερωτευμένη με τον Ορσίνο, παρόλο που δεν τον έχει γνωρίσει ποτέ.
* Η απεικόνιση της επιθυμίας του ίδιου φύλου ως αφύσικη ή κωμική. Αυτό φαίνεται πιο ξεκάθαρα στον χαρακτήρα του Sir Andrew Aguecheek, ο οποίος κάνει συνεχώς αστεία για την έλξη του προς τους άνδρες. Η επιθυμία του δεν λαμβάνεται σοβαρά υπόψη από κανέναν και συχνά τον γελοιοποιούν γι' αυτό.
* Το γεγονός ότι το έργο τελειώνει με έναν παραδοσιακό ετεροφυλόφιλο γάμο. Αυτό ενισχύει την ιδέα ότι η ετεροφυλοφιλία είναι η μόνη αποδεκτή μορφή σεξουαλικού προσανατολισμού.
Η έκφραση της ετεροκανονικότητας στη Δωδέκατη Νύχτα είναι προβληματική γιατί περιθωριοποιεί και αποκλείει τα μη ετεροφυλόφιλα άτομα. Δημιουργεί επίσης ένα κλίμα στο οποίο είναι δύσκολο για τα μη ετεροφυλόφιλα άτομα να είναι ανοιχτά σχετικά με τον σεξουαλικό τους προσανατολισμό.